恒遠(yuǎn)生物|蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)相互作用是指兩個(gè)或兩個(gè)以上蛋白質(zhì)分子通過(guò)非共價(jià)鍵形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的過(guò)程。如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞周期調(diào)控、物質(zhì)代謝等。





常見(jiàn)的研究方法有：

酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀、親和層析、細(xì)胞內(nèi)共定位分析。

以下是對(duì)免疫共沉淀技術(shù)（co-immunoprecipitation,co-IP）進(jìn)行總結(jié)，co-IP常用來(lái)檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)在體內(nèi)是否結(jié)合。




基本原理：

在保證兩種蛋白質(zhì)相互作用的條件下，收集并裂解細(xì)胞。在細(xì)胞裂解液中加入某一種已知蛋白的特異性抗體，孵育后再加入可與特異性抗體結(jié)合的蛋白A/G-瓊脂糖珠（或磁珠）沉淀收獲抗原抗體復(fù)合物，若細(xì)胞中存在與已知蛋白結(jié)合的目標(biāo)蛋白，則可被磁珠沉淀下倆，形成“目標(biāo)蛋白-已知蛋白-抗已知蛋白抗體-磁珠"復(fù)合物。經(jīng)SDS-PAGE后，復(fù)合物可被分離，再經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜鑒定出目標(biāo)蛋白。




優(yōu)勢(shì)：




① 得到的蛋白質(zhì)相互作用是在細(xì)胞內(nèi)天然形成的，反映的是細(xì)胞的生理狀態(tài)；




② 可以分離得到天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。




劣勢(shì)：




① 可能檢測(cè)不到低親和力的瞬時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；




② 不能證明兩種蛋白質(zhì)的直接結(jié)合，其他分子可能起到橋梁作用；




③ 依賴于高質(zhì)量的、可用于免疫沉淀的特異性抗體。




不同類型的免疫共沉淀技術(shù)




1、二次免疫共沉淀技術(shù)：用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)三種蛋白質(zhì)間的相互作用，若要證明X、Y、Z三種蛋白質(zhì)間是否以復(fù)合物形式存在，首先在細(xì)胞裂解液中加入抗X蛋白質(zhì)抗體，免疫沉淀獲得抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)非變性洗脫后，向此復(fù)合物溶液中加入抗蛋白質(zhì)Y的抗體，再收集免疫復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE分析。




2、蛋白質(zhì)降解抑制-免疫共沉淀：若兩種蛋白質(zhì)結(jié)合后，其中一種會(huì)降解，則會(huì)影響IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故需要抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解。




① 對(duì)于通過(guò)溶酶體途徑降解的蛋白質(zhì)，可以加入NH4Cl或氯喹改變細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境，抑制這類蛋白質(zhì)降解。




② 對(duì)于通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解的蛋白質(zhì)，可用MG132抑制，該試劑對(duì)細(xì)胞有毒性，故作用時(shí)間不能太久。




3、核質(zhì)分離-免疫共沉淀：體內(nèi)的許多蛋白質(zhì)是在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭的，研究時(shí)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)時(shí)空問(wèn)題。故先利用核質(zhì)分離技術(shù)得到細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)完整的組分。




4、交聯(lián)免疫共沉淀：能夠使已經(jīng)結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定。避免結(jié)合能力弱或瞬時(shí)結(jié)合的蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中降解。