你知道流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)嗎?

實(shí)驗(yàn)原理：

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段。它可以高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。FCM所有這些功能的實(shí)現(xiàn)依賴于一種特殊的儀器——流式細(xì)胞儀，它是綜合了激光、電腦、流體力學(xué)、光學(xué)和熒光細(xì)胞學(xué)等先進(jìn)技術(shù)的高科技產(chǎn)品。流式細(xì)胞主要是測(cè)量單個(gè)細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)染色后所發(fā)出的散射光和熒光，經(jīng)染色的細(xì)胞在懸液中以單行流過高強(qiáng)度光源的焦點(diǎn)，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過焦點(diǎn)時(shí)，發(fā)出一束散射光／熒光。它們經(jīng)過過濾及光鏡系統(tǒng)收集到一個(gè)光電檢測(cè)器(光電倍增管或一個(gè)固態(tài)裝置)，光檢測(cè)器把散射光定量轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字化后進(jìn)行電子存儲(chǔ)，以后數(shù)據(jù)可以調(diào)出顯示和進(jìn)行分析。流式細(xì)胞術(shù)不僅可測(cè)量細(xì)胞的大小、內(nèi)部顆粒的性狀，還可檢測(cè)細(xì)胞表面和胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等，在細(xì)胞生物學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。




材料與儀器：

培養(yǎng)的細(xì)胞 外周血單個(gè)核細(xì)胞

小牛血清 無水乙醇 RNase A PBS PI Heochst 33342染液。

流式細(xì)胞儀 玻璃管、塑料管 離心機(jī) 熒光顯微鏡 400目的篩網(wǎng)




操作步驟：

一、單細(xì)胞懸液制備方法

流式細(xì)胞術(shù)的分析檢測(cè)建立在單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，制備合格的單個(gè)分散的細(xì)胞懸液是非常關(guān)鍵的一環(huán)。對(duì)不同來源和不同形式的樣品，根據(jù)各種樣品的特點(diǎn)可選擇不同的分散方法。

1. 單層培養(yǎng)細(xì)胞、血液、各種脫落細(xì)胞等樣品，標(biāo)本經(jīng)過簡(jiǎn)單的制備懸液，離心分離處理，就可以得到分散較好的單個(gè)細(xì)胞懸液，是理想的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)象。

2. 對(duì)于不同組織來源的實(shí)體組織標(biāo)本，采用酶消化法、機(jī)械法和化學(xué)試劑處理法來分散細(xì)胞。

3. 石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備，可使大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，從而擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍。樣品制備一般通過切片、脫脂、水化、消化及終止消化后過濾再收集細(xì)胞懸液，去除碎片的單細(xì)胞懸液用70％乙醇固定保存。




二、檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)

1. 培養(yǎng)或分離的細(xì)胞約為1×106，離心沉淀后用0.3ml含10％小牛血清的PBS懸浮，移入1.5ml EP管中，加入0.7ml無水乙醇，置-20℃下固定24h以上。

2. 3000 r/min離心30s，棄上清液，用lml PBS重懸細(xì)胞，再離心洗滌細(xì)胞一次。

3. 棄上清液，沉淀細(xì)胞用100μl 1mg/ml RNase A懸浮，37℃下放置30min。

4. 加入400μl 50μg/ml PI，置暗處10min。

5. 最后用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

根據(jù)流式報(bào)告中給出G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞的百分比、凋亡百分比和細(xì)胞倍體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。




三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡（Heochst 33342/PI雙染色法）

1. 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342，終濃度為l μg/ml；37℃培養(yǎng)箱孵育7——10min。

2. 500——1000 r/min低溫離心5min，棄去染液。

3. 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

4. 400目的篩網(wǎng)過濾1次。

5. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。




四、結(jié)果觀察

1. 根據(jù)流式報(bào)告中給出的G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞的百分比、凋亡細(xì)胞百分比和細(xì)胞倍體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

2. 細(xì)胞凋亡觀察

Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為352nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)為400——500nm，產(chǎn)生藍(lán)色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。

3. 結(jié)果判斷

在藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光。